ESTRATÉGIAS DE PADRONIZAÇÃO DA RT-PCR EM TECIDOS PLACENTÁRIOS FIXADOS EM FORMALINA E INCLUÍDOS EM PARAFINA (FFPE) DE GESTANTES COM E SEM COVID-19.

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Resumo

Introdução: O vírus SARS-CoV-2, responsável pela COVID-19, utiliza a enzima conversora de angiotensina 2 (ECA2) como receptor; essa enzima é expressa na placenta, sugerindo a possibilidade de transmissão vertical do vírus. Além disso, a interação entre o SARS-CoV-2 e a ECA2 pode comprometer as funções biológicas da enzima. Durante a gestação, a ECA2 regula a placentação e as adaptações hemodinâmicas por meio da modulação do sistema renina-angiotensina-aldosterona (SRAA) e do sistema calicreína-cinina (SCC). Alterações nesses processos podem contribuir para o desenvolvimento de complicações gestacionais. Durante a pandemia, muitas regiões enfrentaram limitações na coleta e armazenamento de amostras biológicas, de modo que diversos bancos biológicos com coortes relevantes dispõemapenas de amostras placentárias fixadas em formalina e embebidas/incluídas em parafina (FFPE), material rotineiramente coletado para análise histopatológica e que apresenta baixo custo para coleta, processamento e armazenamento. Entretanto o uso de tecido FFEP em análises moleculares pode representar um desafio, uma vez que, o processo compromete a qualidade e quantidade de material genético,dificultando sua extração e amplificação. Objetivos: Padronizar e validar a técnica de extração de DNA e RNA de placentas FFEP para análises moleculares por RT-PCR, visando avaliar a expressão de genes relevantes na placentação. Metodologia: Foram analisadas 20 amostras de placenta FFEP sendo dez participantes COVID-19-negativas e dez COVID-19-positivas. A extração de DNA e RNA foi feita com o Kit MagMax? FFPE DNA/RNA Ultra Kit (Thermo Fisher Scientific). O DNA e RNA extraídos foram purificados por diafiltração. O c-DNA foi sintetizado utilizando o Kit High-Capacity cDNA Reverse Transcription, para posterior análise de expressão gênica por RT-PCR de genes de interesse relacionados à placentação, inflamação e aos componentes do SRAA e do SCC. Resultados: O material genético extraído apresentava um rendimento médio de 512,62 ng/uL de DNA e de 270,74 ng/uL de RNA, porém 90% das amostras de DNA, e 37,5% das amostras de RNA tinham razão 260/280 abaixo de 1,8 indicando contaminação principalmente por sais. A etapa de diafiltração melhorou a qualidade do DNA extraído em 45%, e para o RNA em 50% Padronizamos a concentração de 50 ng/uL de cDNA e a utilização do endógeno GAPDH para a realização da RT-PCR, entretanto, ocorreu dupla amplificação na curva Melt. Conclusão: Ficam evidentes as dificuldades e limitações da utilização de amostras de placenta FFEP para testes moleculares como RT-PCR. A extração de material genômico utilizando o kit MagMax? FFPE DNA/RNA Ultra fornece rendimento adequado porém com alta concentração de sais, a etapa diafiltração foi eficiente para remoção de sais. Ainda são necessárias otimizações e investigação da integridade do material genômico para adequada utilização nos testes moleculares.