CONDIÇÕES DE CULTIVO DE CÉLULAS MCF-10A: INFLUÊNCIA NA INDUÇÃO DA TRANSIÇÃO EPITÉLIO-MESENQUIMA E ATIVIDADE DE SERINA-PROTEASES

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Resumo

A transição epitélio-mesenquima (TEM) é um processo adotado por células tumorais como mecanismo facilitador da disseminação do tumor primário. Na TEM, as células perdem sua morfologia epitelial típica e adquirem características mesenquimais com maior capacidade de migração. Nesse contexto, serina e metal-proteases modulam o microambiente tumoral contribuindo na degradação da matriz extracelular e ativação de fatores como TGF-beta. O presente trabalho visa investigar como diferentes estímulos modulam o fenótipo celular e a atividade de serina-proteases em células epiteliais de mama humana. As MCF-10A foram cultivadas em meio DMEM/F12, contendo glicose (17,4 mM) e suplementado com EGF (10 ng/ml), hidrocortisona (0,5 ?g/ml), insulina (10 ?g/ml), toxina colérica (100 ng/ml) e soro equino a 5% ou 10%. As diferentes condições analisadas variaram em concentrações de soro e/ou tripsina/EDTA nos subcultivos. O substrato cromogênico S2302 (0,4 mM) foi utilizado para determinar a atividade de calicreína plasmática humana (PKa) por 24 h em duas condições experimentais: diferentes concentrações de glicose (0 mM a 25 mM) e presença ou ausência dos inibidores de serina-proteases o PKSI (inibidor de PKa, 100 µM) e o 4-Cl (inibidor de uroquinase, 100 µM). As análises morfológicas foram realizadas utilizando microscopia óptica, e as imagens na passagem 4 (P4) adquiridas no período entre 7-9 dias de cultivo. O subcultivo utilizando a solução de tripsina 0,25%/EDTA 0,913 mM induziu alterações morfológicas indicativas de TEM, resultando em uma prevalência de 90% de células com morfologia mesenquimal e 10% de células epiteliais (P4). No subcultivo utilizando tripsina 0,05%/EDTA 0,182 mM observou-se uma inversão parcial das populações celulares, com 60% de células mesenquimais e 40% epiteliais (P4). Na condição de subcultivo com tripsina 0,05%/EDTA 0,480 mM, e cultivo das células em meio DMEM/F12 suplementado com soro equino a 10%, observou-se a presença de 60% de células epiteliais e 40% de células mesenquimais. Em contrapartida, a tripsinização realizada com tripsina 0,05%/EDTA 0,480 mM, associada ao cultivo em meio contendo soro equino a 5%, preservou o fenótipo epitelial, com 95% de células epiteliais e 5% mesenquimais (P4). Considerando o fenótipo epitelial, na presença de solução tampão Hepes-Tyrode pH 7,35 após 24 h, a atividade enzimática da PKa apresentou um aumento de aproximadamente 15% em células expostas a concentrações elevadas de glicose (25 mM). Na presença de glicose 19,4 mM houve aumento progressivo da atividade da PKa nas passagens tardias P5, P6 e P7 atingindo aumento de até 24% na presença de PKSI ou 4-Cl. Dados preliminares de microscopia confocal confirmam a presença de PKa nessas células com fenótipo epitelial (P7). Todavia, no fenótipo TEM, adquirido durante os subcultivos com tripsina 0,05%/EDTA 0,182 mM e cultivo na presença de soro equino 10%, as células entre P5 a P10 exibiram um perfil de atividade proteolítica estável, com 83% na presença de PKSI e 82% com 4-Cl, indicando que os inibidores exerceram ação em serina-proteases, destacando-se a PKa, nas células com fenótipo TEM. Nossos resultados até o momento mostram que as MCF-10A exigem um controle rigoroso das condições de cultivo, incluindo as concentrações de tripsina/EDTA e soro utilizadas para evitar a aquisição de características mesenquimais, evidenciando a relevância do microambiente na biologia do tumor. A inibição de serina-proteases na linhagem MCF-10A, com fenótipo TEM induzida pelas condições de subcultivo, reforçam o papel dessa classe de enzimas na aquisição de características tumorais.