PADRONIZAÇÃO DE PROTOCOLO PARA PURIFICAÇÃO DE RNA DE CÉLULAS DO CUMULUS: OTIMIZAÇÃO DE QUANTIDADE E QUALIDADE

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Resumo

Introdução: A preservação adequada de amostras biológicas é etapa determinante para a confiabilidade de análises moleculares, especialmente em estudos que envolvem a extração de RNA a partir de amostras com baixa quantidade celular. Variações nas condições de armazenamento e nos protocolos de extração podem influenciar diretamente o rendimento, a pureza e a integridade do RNA obtido, impactando análises subsequentes, como estudos de expressão gênica e microRNAs. Apesar da ampla utilização de métodos como armazenamento em gelo, estabilização em conservantes, extração por fenol-clorofórmio e sistemas baseados em colunas de sílica, ainda são escassos estudos comparativos sistemáticos que avaliem o impacto combinado dessas estratégias em delineamento intra-paciente. Objetivo: Comparar o impacto de dois métodos de preservação (armazenamento em gelo e estabilização reagente conservante) associados a dois protocolos de extração de RNA (fenol-clorofórmio e coluna de sílica) sobre o rendimento, a pureza e a integridade do RNA extraído de células do cumulus humanos obtidos em ciclos de fertilização in vitro. Métodos: Trata-se de um estudo experimental destinado à avaliação da influência dos métodos de preservação e protocolos de extração na qualidade do RNA obtido de células do cumulus humano. Este projeto faz parte de um estudo maior, no qual será avaliado o perfil de microRNA de células do cumulus de mulheres submetidas a ciclos de fertilização in vitro. Amostras de 10 participantes submetidas à fertilização in vitro, com obtenção mínima de 12 complexos cumulus-oócito por participante. As células do cumulus de cada participante será dividida em duas alíquotas e distribuídas nas quatro condições experimentais: (1) Gelo coluna de sílica,(2) Gelo fenol-clorofórmio, (3)conservante coluna de sílica, e (4) conservante fenol-clorofórmio. A qualidade do RNA será avaliada por meio do sistema Bioanalyzer, com determinação do perfil eletroforético, razão 28S/18S, que fornecerá informações sobre rendimento (concentração) e integridade (RNA Integrity Number - RIN) e a pureza pelo Nanodrop. Resultados Esperados: Espera-se identificar o protocolo que forneça melhores condições quanto ao rendimento, pureza e integridade do RNA em função das estratégias de preservação e purificação empregadas. Os achados poderão contribuir para a padronização metodológica no processamento de células do cumulus destinadas a análises moleculares, fornecendo subsídios técnicos para otimização de protocolos laboratoriais na área da reprodução assistida.