OLIGONUCLEOTÍDEOS ANTISSENSE (ASOS) DIRIGIDOS AO GENE MDR1/ABCD1 (P-GP) PARA TRATAMENTO DE LEUCEMIAS

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Resumo

Introdução: A leucemia é uma neoplasia hematológica caracterizada pela proliferação desordenada de leucócitos imaturos na medula óssea, comprometendo a produção normal de células sanguíneas e resultando em quadros de anemia e trombocitopenia. Um dos maiores obstáculos ao tratamento eficaz das leucemias, tanto mieloides quanto linfóides, é o fenótipo de multirresistência a drogas (MDR), frequentemente associado à superexpressão da P-glicoproteína (P-gp). A bomba de efluxo, codificada pelo gene MDR1 (ABCB1), promove a extrusão ativa de quimioterápicos para o meio extracelular, reduzindo a sensibilidade tumoral ao tratamento. Nesse contexto, os oligonucleotídeos antisense (ASOs) surgem como uma estratégia promissora, uma vez que consistem em pequenas sequências de ácidos nucleicos que podem se ligar ao RNA mensageiro específico, bloqueando sua tradução. Objetivo: O presente projeto propõe o estudo do impacto da superexoressão da P-gp em linhagens humanas HL-60 e K562, derivada de Leucemia promielocítica aguda e leucemia mielocítica crônica, respectivamente, e no uso de ASOs como ferramenta terapêutica para silenciar a expressão do MDR1 e reduzir os mecanismos de resistência celular aos quimioterápicos. Materiais e Métodos: Foi realizada uma análise das sequências e isoformas do gene MDR1 na literatura, visando identificar regiões-alvo adequadas para o desenvolvimento dos ASOs, garantindo maior afinidade molecular e especificidade ao alvo terapêutico. A região escolhida para o desenvolvimento dos ASOs é localizada próximo ao códon de iniciação ATG do gene MDR1. As linhagens HL-60 e K-562 foram cultivadas em meio RPMI 1640 e submetidas à exposição crescente do quimioterápico doxurrubicina para se tornarem resistentes. Foram realizados ensaios de viabilidade celular por resazurina, análises de fluorescência com doxorrubicina no leitor de placa F7000 (HITACHI), avaliação da expressão gênica da P-gp por RT-qPCR (Power SYBR Green PCR Master Mix Applied Biosystems/Thermo Fisher) e avaliação da marcação de células com superexpressão das bombas de P-gp com fluoroforo por citometria de fluxo (BD FACSCalibur ). Avaliaçaõ do perfil metabólico por IR-Biotyper (Bruker). Resultados parciais: Os ensaios de viabilidade celular demonstraram correlação entre a concentração de doxorrubicina e a resposta metabólica das células HL-60 e K-562, permitindo a seleção das condições experimentais para os estudos de resistência. Os ensaios de fluorescência utilizando doxorrubicina mostraram curvas compatíveis com os padrões esperados, confirmando a captação intracelular da droga. Nos experimentos de citometria de fluxo, foi comparada e avaliada a retenção intracelular de fluoróforos na presença de um peptídeo inibidor da P-gp entre células resistentes e não resistentes. As células tratadas com o inibidor apresentaram aproximadamente 73% de marcação, enquanto as células sem tratamento apresentaram cerca de 50%, indicando aumento da retenção intracelular do fluoróforo e redução da atividade da bomba de efluxo na presença de inibidor de bomba. As análises por IR Biotyper demonstraram diferenças nos perfis das células submetidas à seleção com doxorrubicina e as células controle. Obtendo alterações metabólicas e estruturais decorrentes da adaptação celular à exposição ao quimioterápico. Conclusão: Os resultados obtidos até o momento indicam o sucesso no estabelecimento de modelos celulares resistentes à doxorrubicina nas linhagens HL-60 e K-562, evidenciado por alterações na viabilidade celular, retenção intracelular de fluoróforos e perfil metabólico. Os dados de citometria de fluxo sugerem a participação da P-glicoproteína nos mecanismos de resistência observados, uma vez que a inibição da bomba de efluxo promoveu aumento da retenção intracelular do marcador fluorescente. Além disso, as alterações detectadas pelo IR Biotyper reforçam a ocorrência de adaptações celulares associadas ao fenótipo de multirresistência.