GERAÇÃO DE CÉLULAS CAR-MONÓCITO LIKE DIRECIONADAS CONTRA CARCINOMA RENAL DE CÉLULAS CLARAS (CCRCC) ATRAVÉS DA TRANSDUÇÃO LENTIVIRAL

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Resumo

Introdução. As terapias convencionais à base de células T modificadas com receptor quimérico de antígeno (CAR-T) têm enfrentado limitações no tratamento de tumores sólidos. Nesse contexto, uma abordagem inovadora é a plataforma de CAR monócitos e CAR macrófagos. Entre as vantagens, destaca-se o remodelamento do microambiente tumoral (TME), e portanto, maior capacidade de migração celular. Em contrapartida, essas células apresentam mecanismos de resistência à transdução viral, o que dificulta sua alteração genética. Diante desse cenário, o vpx é uma proteína acessória do HIV-1 que, associada ao lentivírus contendo o gene CAR, pode promover uma maior taxa de transdução. Nessa perspectiva, o carcinoma renal de células claras (ccRCC) é um alvo em potencial para o desenvolvimento desta imunoterapia, ao passo que exibe elevada expressão de anidrase carbônica IX (CAIX) e do ligante de checkpoint imunológico PD-L1. Objetivos. Produzir lentivírus que contenham o gene do CAR isolado e associado ao Vpx, avaliar a influência da proteína por meio da transdução em células de linhagem monocítica (THP1) e monócitos primários isolados de PBMC, e testar o potencial citotóxico dos CAR monócitos contra células de linhagem de câncer renal de células claras (SKRC59). Métodos. Primeiramente, partículas lentivirais codificadoras de CAR foram desenvolvidas por meio de transfecção transiente de plasmídeos estruturais e de plasmídeos codificadores de CAR em células 293T Lenti-X (grupo controle). Para o grupo com Vpx associado ao gene do CAR, partículas lentivirais codificadoras de CAR foram produzidas por co-transfecção de GAG/Pol-Vpx (VPX-CAR). Um terceiro grupo foi desenvolvido, com associação do Vpx ao CAR apenas no momento da transdução. Para isso, ?partículas semelhantes a vírus? (VLPs) foram geradas por meio da transfecção de VSVG e GAG/Pol-VPX e combinadas separadamente com partículas lentivirais codificadoras de CAR, previamente produzidas sem Vpx (VPX VLP CAR), apenas no momento da transdução (VPX VLP CAR). Os vírus e os complexos vírus VLPs foram então concentrados, titulados e utilizados para transduzir células HEK, THP-1. Em seguida, a viabilidade e os níveis de transdução foram avaliados por citometria de fluxo. Foi realizado também a transdução lentiviral em monócitos primários e, ensaio de citotoxicidade com células SKRC59 com expressão de PD-L1, CAIX e Luciferase, através de bioluminescência por luciferase. Resultados. O título médio dos vírus em células HEK-293T foi de aproximadamente 3 a 7,45x107 TU/?L para todos os grupos. A MOI de 0,5 resultou em um número maior de células THP-1 viáveis transduzidas em todos os grupos. A adição separada de VLP VPX e lentivírus codificante para o CAR no momento da transdução resultou em um incremento de 2,5 vezes na quantidade final de células THP-1 transduzidas viáveis quando comparadas ao grupo de células THP-1 transduzidas com lentivírus CAR previamente produzidos em conjunto com VPX. Essas construções serão posteriormente transduzidas em monócitos primários e testadas em um ensaio de citotoxicidade em células de ccRCC. Conclusão: Após a padronização da produção lentiviral, concluímos que a condição VPX VLP CAR apresentou maiores taxas de transdução e viabilidade, com maior rendimento global no número de células transduzidas viáveis.